通過(guò)RT-PCR法擴(kuò)增出茶樹(shù)咖啡堿合酶(TCS)cDNA編碼區(qū)全序列，并將其克隆到表達(dá)載體pET32a(+)中，得到重組質(zhì)粒pET-TCS，在表達(dá)宿主菌B121trxB(DE3)中高效表達(dá)，產(chǎn)生相對(duì)分子質(zhì)量約為62000的融合蛋白。該融合蛋白包括112個(gè)氨基酸殘基的硫氧還原蛋白及370個(gè)氨基酸殘基的茶樹(shù)TCS蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)的融合蛋白產(chǎn)量逐漸增加，表達(dá)蛋白總量最高可達(dá)到菌體總蛋白的39．14％；在15、25和37℃ 3個(gè)不同的誘導(dǎo)溫度下，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生融合蛋白，而且產(chǎn)生的總量及其可溶性部分所占比例均隨誘導(dǎo)溫度升高而增加；在菌體的各個(gè)部位中，融合蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中以可溶的形式進(jìn)行表達(dá)，有少量在外周質(zhì)中表達(dá)或以包涵體形式在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。另外，體外酶促反應(yīng)表明，表達(dá)的融合蛋白能催化可可堿甲基化生成咖啡堿，具有正常的生物學(xué)活性。
完成機(jī)構(gòu)：[1]安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部茶葉生物化學(xué)和生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036 [2]安徽省教育學(xué)院，安徽合肥230061
