黃酮類化合物是存在于植物中的一類低分子次生代謝產(chǎn)物。近年來的研究表明，黃酮類化合物具有廣泛的生理功能，如清除自由基、抗癌、抗氧化、抗病毒等生理活性和藥理作用，顯示了黃酮化合物在醫(yī)藥及食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間。
蘆筍是一種營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值均極高的蔬菜。分析表明，蘆筍中除含多種營(yíng)養(yǎng)素外，還含有抗氧化劑、細(xì)胞免疫激活劑以及細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等物質(zhì)，這些成分包括皂苷、固醇、黃酮苷、異黃酮、含硫氨基酸、維生素類、糖類免疫激活劑以及錳、鋅、銅、鐵等微量礦物質(zhì)圜。蘆筍雖好，但新鮮蘆筍不宜保存，存放3d一5d其新鮮度大幅度降低，組織逐漸變硬并失去大量營(yíng)養(yǎng)素。采用現(xiàn)代技術(shù)將新鮮蘆筍制成蘆筍茶，不僅保留了原蘆筍中的營(yíng)養(yǎng)成分，而且可以長(zhǎng)期存放。目前，對(duì)蘆筍茶中黃酮類化合物的研究還較少。微波是一種高頻電磁波，具有很強(qiáng)的熱效應(yīng)。微波用于天然成分的提取，具有選擇性強(qiáng)、操作時(shí)間短、溶劑耗量小、目標(biāo)組分得率高且能極大限度地保留分離組分的天然活性等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以蘆筍茶為原料，探討用微波法從蘆筍茶中提取黃酮的最佳工藝，并對(duì)提取物的抗氧化性進(jìn)行研究，為蘆筍茶的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)依據(jù)。
1材料與方法
1.1主要原輔材料
蘆筍茶：由國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程中心(天津)提供。蘆丁，亞硝酸鈉，硝酸鋁，無水乙醇，硫酸亞鐵，三氯醋酸，硫代巴比妥酸，二苯代苦味肼基自由基(DPPH)，以上試劑均為分析純，購(gòu)于天津市化學(xué)試劑公司。
1.2主要儀器與設(shè)備
FW80微型高速萬能試樣粉碎機(jī)：上海長(zhǎng)樂電器廠;VIS一7220型分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司;FA1104N型電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司;LD5—2A型離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠;格蘭仕微波爐：順德格蘭仕電器實(shí)業(yè)有限公司;HZS—H型水浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;79—1型磁力攪拌機(jī)：上虞市宏興機(jī)械儀器實(shí)業(yè)公司。
1-3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1提取工藝流程
蘆筍茶一預(yù)處理一乙醇浸泡一微波處理一離心分離一取上清液一測(cè)定黃酮含量操作要點(diǎn)：蘆筍茶過40目篩，得到蘆筍茶粉末，備用。取蘆筍茶粉用一定濃度的乙醇浸泡后，再在微波條件下進(jìn)行提取，離心后取上清液，測(cè)定其中黃酮的含量，并計(jì)算黃酮得率。
1.3-2單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
基本實(shí)驗(yàn)條件：微波功率：中檔(700W);加熱時(shí)間：45s;料液比：1：20;乙醇濃度：70%;室溫。
1.3.2.1微波時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響
按提取基本條件，分別考察微波15s、30s.45s和60s時(shí)對(duì)黃酮提取得率的影響。
1.3.2.2料液比對(duì)黃酮得率的影響
按提取基本條件，分別考察料液比1：15、1：20、1：25和1：30時(shí)對(duì)黃酮提取得率的影響。
1.3.2.3乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響按提取基本條件，分別考察乙醇濃度為30%、50%、70%和90%時(shí)對(duì)黃酮提取得率的影響。
1.3.3正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
利用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察時(shí)間、料液比、乙醇濃度三個(gè)因素對(duì)提取效果的相互影響。實(shí)驗(yàn)選用L9(34)設(shè)計(jì)研究提取條件對(duì)提取效果影響的主要因素，并確定最佳工藝。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。
表1正交實(shí)驗(yàn)因素及水平表
1.4指標(biāo)測(cè)定
1.4.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精確吸取0.1mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL于6個(gè)25mL比色管中，用30%的乙醇補(bǔ)至10mL，加人1mL5%NaNO2，搖勻，放置6min后，加人1mL10%A1(NO3)3，再放置6min，加人10mL1moL/LNaOH，搖勻顯色，定容，靜置15min，以零管為空白，在510nm處測(cè)定系列吸光度圄。用最小二乘法做線性回歸，求得蘆丁濃度(Y)與吸光度(A)的關(guān)系曲線。
1.4.2黃酮含量及黃酮得率的計(jì)算
黃酮含量(%)=(Yx25x25x25/Mx5x2xl000xl00%(1)
式中：Y —— 黃酮濃度(mg/mL)
25——樣液稀釋后的體積(mL)
M——原料質(zhì)量(g)
5.2——吸取的樣液量(mL)
式(2)中蘆筍茶中的總黃酮含量的測(cè)定：蘆筍茶用70%乙醇浸潤(rùn)后，于80℃水浴浸提6h，濾渣采用相同方法重復(fù)提取3次，將3次的提取液合并后測(cè)得的黃酮含量作為蘆筍茶中的總黃酮含量。按此方法測(cè)得的總黃酮含量為3.74%。
1.4.3蘆筍茶中黃酮的抗氧化功能研究
1.4.3.1清除自由基的測(cè)定一DPPH法
DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517nm處有最大吸收。當(dāng)在DPPH溶液中加入自由基清除劑后，溶液顏色變淺，517nm處的吸收光度變小，且吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈線性關(guān)系，可用于檢測(cè)自由基被清除的程度，從而評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力。其能力用抑制率來表示，抑制率越大，抗氧化能力越強(qiáng)。配制不同黃酮濃度的樣品液(見表2)，并按下面的測(cè)量方法測(cè)定抑制率。
表2黃酮樣品液制備
精確吸取樣品溶液2.0mL于試管中，加人2*10―4mol的DPPH溶液2.0mL，搖勻，放置30min，以80%乙醇為空白，分別測(cè)定517nm處的吸光度Ai。同時(shí)，測(cè)定樣品溶液2.0mL與2.0mL80%乙醇混合液517nm處的吸光度。再測(cè)定DPPH溶液2.0mL與乙醇2.0mL混合液517nm處的吸光度Ac。每組平行測(cè)定3次，取平均值后根據(jù)以下公式計(jì)算樣品抑制率：
抑制率=[1一(Ai—Aj)/Ac]×100%(3)
式中Ai—樣品液與DPPH溶液混合液的吸光度;
Aj——樣品液與乙醇混合液的吸光度;
Ac——DPPH溶液與乙醇混合液的吸光度。
1.4.3.2抗脂質(zhì)過氧化活性的測(cè)定
黃酮類化合物是一類性能優(yōu)良的天然食品抗氧化劑，本實(shí)驗(yàn)采用依賴雞卵黃脂蛋白的脂質(zhì)過氧化模型，測(cè)定樣品抗脂質(zhì)氧化能力。抑制率越大，則樣品抗脂質(zhì)過氧化能力越強(qiáng)。
操作步驟：新鮮卵黃用等體積的0.1mol/LpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)按1：1配成懸液，并按1：25倍稀釋，磁力攪拌30min。在試管中加入卵黃懸液0.4mL;并分別加入樣品0.2mE(對(duì)照管PBS);再加入25mmo1的硫酸亞鐵0.4mL;用0.1mol/LpH7.4PBS補(bǔ)至4.0mL，置于37℃水浴振蕩50min。取出后加入20%三氯醋酸1mL，靜置10min后，3000r/min離心15min，取上清液4mL加入0.8%硫代巴比妥酸2mL，塞緊管口100℃水浴15min，空白管以PBS取代上清液，其余相同。532nm測(cè)光吸收，平行測(cè)定3次，取平均值并根據(jù)公式
(4)計(jì)算樣品抑制率：
抑制率%=(對(duì)照液吸光度一樣品液吸光度)/對(duì)照液吸光度×100%(4)
2結(jié)果與討論
2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)
用最小二乘法作線性回歸得蘆丁濃度與吸光度關(guān)系曲線的回歸方程式：
Y=O.09712A+4.482×10R2=0.9998(5)
其中：Y為蘆丁濃度(mg/mL);
A為吸光度值。
圖1蘆丁樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.2微波提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.2.1微波時(shí)間對(duì)黃酮含量的影響
微波提取時(shí)間對(duì)蘆筍茶黃酮含量的影響見圖2。
圖2微波時(shí)間與黃酮得率的關(guān)系
圖2結(jié)果表明，當(dāng)提取時(shí)間為15S時(shí)，蘆筍茶中的黃酮不能充分轉(zhuǎn)移到提取液中，黃酮含量比較低;以后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮含量增加，在45S時(shí)達(dá)到峰值，黃酮含量最高;此后，時(shí)間繼續(xù)增加，黃酮提取率反而降低，這可能是微波過程中產(chǎn)生的熱能會(huì)造成黃酮組分損失的緣故。
2.2.2料液比對(duì)黃酮含量的影響
圖3顯示的是料液比對(duì)提取蘆筍茶黃酮的影響。圖3結(jié)果表明，隨著料液比的增加，黃酮含量也相應(yīng)增加，但當(dāng)料液比達(dá)到1：25后，黃酮含量增加不明顯，這說明黃酮已經(jīng)充分轉(zhuǎn)移到提取液中，增加乙醇體積，黃酮含量將不再明顯增加。而且料液比過大，將不利于后續(xù)的濃縮工藝。所以，微波時(shí)的料液比選擇在1：25較好。
圖3料液比與黃酮得率的關(guān)系
2.2.3乙醇濃度對(duì)黃酮含量的影響
乙醇濃度對(duì)黃酮含量的影響見圖4。圖4結(jié)果表明，隨著乙醇濃度的增加，黃酮得率增加，在乙醇濃度為70%時(shí)達(dá)到最大值;繼續(xù)增加乙醇濃度，黃酮的提取效果趨于平緩，考慮經(jīng)濟(jì)因素，乙醇濃度可以選擇在70%-80%。
圖4乙醇濃度與黃酮得率的關(guān)系
2.3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
表3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，表3表明，各種因素對(duì)提取效果影響的主次順序?yàn)椋阂掖紳舛?gt;時(shí)間>料液比。最佳工藝條件為：時(shí)間45S，料液比1：25，乙醇濃度80%，在此工藝條件下所得黃酮含量為3.29%，黃酮得率為88.0%。
2.4清除自由基活性的結(jié)果(見表4及圖5)
表4不同濃度樣品液的吸光度值
圖5黃酮提取物濃度與自由基抑制率的關(guān)系
由表4、圖5結(jié)果知，樣品液對(duì)自由基有較好的清除作用，隨著樣品液濃度增加，清除作用加強(qiáng)，但當(dāng)濃度增大到一定值時(shí)，清除率不再隨濃度的增加而改變。本實(shí)驗(yàn)中樣品液濃度在0.66mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到最大值，此濃度下的抑制率為91.2%。為了對(duì)蘆筍茶提取液的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)將樣品液與TBHQ的抗氧化能力進(jìn)行了比較。配制濃度為0.66m咖L的TBHQ溶液，相同條件下測(cè)得其抑制率為92.3%。比較可知，在相同濃度下蘆筍茶提取液清除自由基的能力與TBHQ相當(dāng)，具有很強(qiáng)的抗氧化能力。目前，對(duì)蘆筍茶的抗氧化活性方面的研究尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為蘆筍茶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
2.5抗脂質(zhì)過氧化的結(jié)果(見表5)
表5樣品的抗脂質(zhì)氧化能力
表5結(jié)果表明，樣品對(duì)脂質(zhì)過氧化物有一定的抑制作用，在濃度為1.32mg/mL時(shí)，抑制率為14.4%。將樣品液的抑制率與Vc的作比較，在相同抑制率下，Vc的濃度為0.1mg/mL，即13g蘆筍茶的抗脂質(zhì)氧化能力相當(dāng)于1gVc所具有的抗脂質(zhì)氧化能力。由此可見，蘆筍茶提取液具有較好的抗脂質(zhì)氧化能力。
3結(jié)論
由單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到蘆筍茶中黃酮的最佳微波提取條件為：乙醇濃度8O%、微波時(shí)間45S、料液比1：25。在此條件下得到的提取液中的黃酮含量為3.29%，黃酮得率為88.0%。對(duì)蘆筍茶提取液中黃酮的抗氧化性研究表明：提取液對(duì)自由基有很強(qiáng)的清除作用，清除效果隨提取液濃度的不同而變化，在濃度為0.66arg/mE時(shí)的清除效果最好，抑制率為91.2%。此外，蘆筍茶提取液有一定的抗脂質(zhì)氧化能力，在濃度為1.32mg/mL時(shí)，抑制率為14.4%。
