黃酮類(lèi)化合物是存在于植物中的一類(lèi)低分子次生代謝產(chǎn)物。近年來(lái)的研究表明，黃酮類(lèi)化合物具有廣泛的生理功能，如清除自由基、抗癌、抗氧化、抗病毒等生理活性和藥理作用，顯示了黃酮化合物在醫藥及食品領(lǐng)域具有廣闊的應用空間。
蘆筍是一種營(yíng)養和藥用價(jià)值均極高的蔬菜。分析表明，蘆筍中除含多種營(yíng)養素外，還含有抗氧化劑、細胞免疫激活劑以及細胞生長(cháng)調節劑等物質(zhì)，這些成分包括皂苷、固醇、黃酮苷、異黃酮、含硫氨基酸、維生素類(lèi)、糖類(lèi)免疫激活劑以及錳、鋅、銅、鐵等微量礦物質(zhì)圜。蘆筍雖好，但新鮮蘆筍不宜保存，存放3d一5d其新鮮度大幅度降低，組織逐漸變硬并失去大量營(yíng)養素。采用現代技術(shù)將新鮮蘆筍制成蘆筍茶，不僅保留了原蘆筍中的營(yíng)養成分，而且可以長(cháng)期存放。目前，對蘆筍茶中黃酮類(lèi)化合物的研究還較少。微波是一種高頻電磁波，具有很強的熱效應。微波用于天然成分的提取，具有選擇性強、操作時(shí)間短、溶劑耗量小、目標組分得率高且能極大限度地保留分離組分的天然活性等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗以蘆筍茶為原料，探討用微波法從蘆筍茶中提取黃酮的最佳工藝，并對提取物的抗氧化性進(jìn)行研究，為蘆筍茶的開(kāi)發(fā)利用提供了基礎依據。
1材料與方法
1.1主要原輔材料
蘆筍茶：由國家農產(chǎn)品保鮮工程中心(天津)提供。蘆丁，亞硝酸鈉，硝酸鋁，無(wú)水乙醇，硫酸亞鐵，三氯醋酸，硫代巴比妥酸，二苯代苦味肼基自由基(DPPH)，以上試劑均為分析純，購于天津市化學(xué)試劑公司。
1.2主要儀器與設備
FW80微型高速萬(wàn)能試樣粉碎機：上海長(cháng)樂(lè )電器廠(chǎng);VIS一7220型分光光度計：北京瑞利分析儀器公司;FA1104N型電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司;LD5—2A型離心機：北京醫用離心機廠(chǎng);格蘭仕微波爐：順德格蘭仕電器實(shí)業(yè)有限公司;HZS—H型水浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;79—1型磁力攪拌機：上虞市宏興機械儀器實(shí)業(yè)公司。
1-3實(shí)驗方法
1.3.1提取工藝流程
蘆筍茶一預處理一乙醇浸泡一微波處理一離心分離一取上清液一測定黃酮含量操作要點(diǎn)：蘆筍茶過(guò)40目篩，得到蘆筍茶粉末，備用。取蘆筍茶粉用一定濃度的乙醇浸泡后，再在微波條件下進(jìn)行提取，離心后取上清液，測定其中黃酮的含量，并計算黃酮得率。
1.3-2單因素實(shí)驗設計
基本實(shí)驗條件：微波功率：中檔(700W);加熱時(shí)間：45s;料液比：1：20;乙醇濃度：70%;室溫。
1.3.2.1微波時(shí)間對黃酮得率的影響
按提取基本條件，分別考察微波15s、30s.45s和60s時(shí)對黃酮提取得率的影響。
1.3.2.2料液比對黃酮得率的影響
按提取基本條件，分別考察料液比1：15、1：20、1：25和1：30時(shí)對黃酮提取得率的影響。
1.3.2.3乙醇濃度對黃酮得率的影響按提取基本條件，分別考察乙醇濃度為30%、50%、70%和90%時(shí)對黃酮提取得率的影響。
1.3.3正交實(shí)驗設計
利用正交實(shí)驗進(jìn)一步考察時(shí)間、料液比、乙醇濃度三個(gè)因素對提取效果的相互影響。實(shí)驗選用L9(34)設計研究提取條件對提取效果影響的主要因素，并確定最佳工藝。實(shí)驗設計如表1。
表1正交實(shí)驗因素及水平表
1.4指標測定
1.4.1蘆丁標準曲線(xiàn)的繪制
精確吸取0.1mg/mL蘆丁標準溶液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL于6個(gè)25mL比色管中，用30%的乙醇補至10mL，加人1mL5%NaNO2，搖勻，放置6min后，加人1mL10%A1(NO3)3，再放置6min，加人10mL1moL/LNaOH，搖勻顯色，定容，靜置15min，以零管為空白，在510nm處測定系列吸光度圄。用最小二乘法做線(xiàn)性回歸，求得蘆丁濃度(Y)與吸光度(A)的關(guān)系曲線(xiàn)。
1.4.2黃酮含量及黃酮得率的計算
黃酮含量(%)=(Yx25x25x25/Mx5x2xl000xl00%(1)
式中：Y —— 黃酮濃度(mg/mL)
25——樣液稀釋后的體積(mL)
M——原料質(zhì)量(g)
5.2——吸取的樣液量(mL)
式(2)中蘆筍茶中的總黃酮含量的測定：蘆筍茶用70%乙醇浸潤后，于80℃水浴浸提6h，濾渣采用相同方法重復提取3次，將3次的提取液合并后測得的黃酮含量作為蘆筍茶中的總黃酮含量。按此方法測得的總黃酮含量為3.74%。
1.4.3蘆筍茶中黃酮的抗氧化功能研究
1.4.3.1清除自由基的測定一DPPH法
DPPH是一種穩定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517nm處有最大吸收。當在DPPH溶液中加入自由基清除劑后，溶液顏色變淺，517nm處的吸收光度變小，且吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈線(xiàn)性關(guān)系，可用于檢測自由基被清除的程度，從而評價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力。其能力用抑制率來(lái)表示，抑制率越大，抗氧化能力越強。配制不同黃酮濃度的樣品液(見(jiàn)表2)，并按下面的測量方法測定抑制率。
表2黃酮樣品液制備
精確吸取樣品溶液2.0mL于試管中，加人2*10―4mol的DPPH溶液2.0mL，搖勻，放置30min，以80%乙醇為空白，分別測定517nm處的吸光度Ai。同時(shí)，測定樣品溶液2.0mL與2.0mL80%乙醇混合液517nm處的吸光度。再測定DPPH溶液2.0mL與乙醇2.0mL混合液517nm處的吸光度Ac。每組平行測定3次，取平均值后根據以下公式計算樣品抑制率：
抑制率=[1一(Ai—Aj)/Ac]×100%(3)
式中Ai—樣品液與DPPH溶液混合液的吸光度;
Aj——樣品液與乙醇混合液的吸光度;
Ac——DPPH溶液與乙醇混合液的吸光度。
1.4.3.2抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性的測定
黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)性能優(yōu)良的天然食品抗氧化劑，本實(shí)驗采用依賴(lài)雞卵黃脂蛋白的脂質(zhì)過(guò)氧化模型，測定樣品抗脂質(zhì)氧化能力。抑制率越大，則樣品抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力越強。
操作步驟：新鮮卵黃用等體積的0.1mol/LpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)按1：1配成懸液，并按1：25倍稀釋?zhuān)帕嚢?0min。在試管中加入卵黃懸液0.4mL;并分別加入樣品0.2mE(對照管PBS);再加入25mmo1的硫酸亞鐵0.4mL;用0.1mol/LpH7.4PBS補至4.0mL，置于37℃水浴振蕩50min。取出后加入20%三氯醋酸1mL，靜置10min后，3000r/min離心15min，取上清液4mL加入0.8%硫代巴比妥酸2mL，塞緊管口100℃水浴15min，空白管以PBS取代上清液，其余相同。532nm測光吸收，平行測定3次，取平均值并根據公式
(4)計算樣品抑制率：
抑制率%=(對照液吸光度一樣品液吸光度)/對照液吸光度×100%(4)
2結果與討論
2.1標準曲線(xiàn)(見(jiàn)圖1)
用最小二乘法作線(xiàn)性回歸得蘆丁濃度與吸光度關(guān)系曲線(xiàn)的回歸方程式：
Y=O.09712A+4.482×10R2=0.9998(5)
其中：Y為蘆丁濃度(mg/mL);
A為吸光度值。
圖1蘆丁樣品標準曲線(xiàn)
2.2微波提取的單因素實(shí)驗結果
2.2.1微波時(shí)間對黃酮含量的影響
微波提取時(shí)間對蘆筍茶黃酮含量的影響見(jiàn)圖2。
圖2微波時(shí)間與黃酮得率的關(guān)系
圖2結果表明，當提取時(shí)間為15S時(shí)，蘆筍茶中的黃酮不能充分轉移到提取液中，黃酮含量比較低;以后隨著(zhù)提取時(shí)間的延長(cháng)，黃酮含量增加，在45S時(shí)達到峰值，黃酮含量最高;此后，時(shí)間繼續增加，黃酮提取率反而降低，這可能是微波過(guò)程中產(chǎn)生的熱能會(huì )造成黃酮組分損失的緣故。
2.2.2料液比對黃酮含量的影響
圖3顯示的是料液比對提取蘆筍茶黃酮的影響。圖3結果表明，隨著(zhù)料液比的增加，黃酮含量也相應增加，但當料液比達到1：25后，黃酮含量增加不明顯，這說(shuō)明黃酮已經(jīng)充分轉移到提取液中，增加乙醇體積，黃酮含量將不再明顯增加。而且料液比過(guò)大，將不利于后續的濃縮工藝。所以，微波時(shí)的料液比選擇在1：25較好。
圖3料液比與黃酮得率的關(guān)系
2.2.3乙醇濃度對黃酮含量的影響
乙醇濃度對黃酮含量的影響見(jiàn)圖4。圖4結果表明，隨著(zhù)乙醇濃度的增加，黃酮得率增加，在乙醇濃度為70%時(shí)達到最大值;繼續增加乙醇濃度，黃酮的提取效果趨于平緩，考慮經(jīng)濟因素，乙醇濃度可以選擇在70%-80%。
圖4乙醇濃度與黃酮得率的關(guān)系
2.3正交實(shí)驗結果與討論
表3正交實(shí)驗結果
正交實(shí)驗結果見(jiàn)表3，表3表明，各種因素對提取效果影響的主次順序為：乙醇濃度>時(shí)間>料液比。最佳工藝條件為：時(shí)間45S，料液比1：25，乙醇濃度80%，在此工藝條件下所得黃酮含量為3.29%，黃酮得率為88.0%。
2.4清除自由基活性的結果(見(jiàn)表4及圖5)
表4不同濃度樣品液的吸光度值
圖5黃酮提取物濃度與自由基抑制率的關(guān)系
由表4、圖5結果知，樣品液對自由基有較好的清除作用，隨著(zhù)樣品液濃度增加，清除作用加強，但當濃度增大到一定值時(shí)，清除率不再隨濃度的增加而改變。本實(shí)驗中樣品液濃度在0.66mg/mL時(shí)抑制率達到最大值，此濃度下的抑制率為91.2%。為了對蘆筍茶提取液的抗氧化能力進(jìn)行評價(jià)，實(shí)驗將樣品液與TBHQ的抗氧化能力進(jìn)行了比較。配制濃度為0.66m咖L的TBHQ溶液，相同條件下測得其抑制率為92.3%。比較可知，在相同濃度下蘆筍茶提取液清除自由基的能力與TBHQ相當，具有很強的抗氧化能力。目前，對蘆筍茶的抗氧化活性方面的研究尚未見(jiàn)報道，本實(shí)驗的研究結果為蘆筍茶的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了實(shí)驗證據。
2.5抗脂質(zhì)過(guò)氧化的結果(見(jiàn)表5)
表5樣品的抗脂質(zhì)氧化能力
表5結果表明，樣品對脂質(zhì)過(guò)氧化物有一定的抑制作用，在濃度為1.32mg/mL時(shí)，抑制率為14.4%。將樣品液的抑制率與Vc的作比較，在相同抑制率下，Vc的濃度為0.1mg/mL，即13g蘆筍茶的抗脂質(zhì)氧化能力相當于1gVc所具有的抗脂質(zhì)氧化能力。由此可見(jiàn)，蘆筍茶提取液具有較好的抗脂質(zhì)氧化能力。
3結論
由單因素實(shí)驗和正交實(shí)驗結果得到蘆筍茶中黃酮的最佳微波提取條件為：乙醇濃度8O%、微波時(shí)間45S、料液比1：25。在此條件下得到的提取液中的黃酮含量為3.29%，黃酮得率為88.0%。對蘆筍茶提取液中黃酮的抗氧化性研究表明：提取液對自由基有很強的清除作用，清除效果隨提取液濃度的不同而變化，在濃度為0.66arg/mE時(shí)的清除效果最好，抑制率為91.2%。此外，蘆筍茶提取液有一定的抗脂質(zhì)氧化能力，在濃度為1.32mg/mL時(shí)，抑制率為14.4%。
